中國科學(xué)院昆明動物研究所*近宣布，宿兵研究組利用激光顯微切割和微量樣本，與中南民族大學(xué)中國人類腦庫中心合作RNA測序技術(shù)分析了人腦扣帶回紡錘形神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄地圖。該項目由中國科學(xué)院試點項目和國家自然科學(xué)基金委員會重點項目資助。相關(guān)成果已發(fā)表在國際知名神經(jīng)生物學(xué)雜志上《Cerebral Cortex》上。

  項目介紹

  研究表明，舊大陸猴、猿、人類等靈長類大腦進(jìn)化出一種新的神經(jīng)細(xì)胞，稱為紡錘形神經(jīng)元（VEN），在人腦中VEN這種神經(jīng)元存在于猴子等更原始的靈長類中。神經(jīng)生物學(xué)家猜測VEN可能參與人類社會認(rèn)知能力等**認(rèn)知功能，但由于VEN人們對大腦分布的局限性(只集中在前腦島和前扣帶回兩個腦區(qū))和技術(shù)上的局限性VEN確切的功能幾乎一無所知。因此，構(gòu)建這類細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄圖譜是了解細(xì)胞功能的重要基礎(chǔ)工作。

  宿兵研究組利用激光顯微切割和微量樣本RNA發(fā)現(xiàn)了300多種測序技術(shù)VEN特異表達(dá)升降基因，識別4個新基因VEN標(biāo)記基因。對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些基因和VEN形態(tài)發(fā)育(如樹突分支、髓鞘化等)與功能(如人類社會情感疾病等)密切相關(guān)。).人類VEN轉(zhuǎn)錄圖譜的解析，為了解這類在靈長類大腦進(jìn)化和人類大腦起源中扮演重要角色的神經(jīng)元提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為研究人類神經(jīng)精神疾?。ㄈ缱蚤]癥等）的發(fā)病機(jī)制提供了重要信息。

  激光顯微切割技術(shù)在本研究中分離細(xì)胞并提取RNA它起著重要的作用。

  激光顯微切割技術(shù)的發(fā)展歷程

  顯微切割技術(shù)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的一項新技術(shù)。它可以從組織切片或細(xì)胞涂層的任何區(qū)域切割數(shù)百個、數(shù)十個類似細(xì)胞，甚*單個細(xì)胞，然后進(jìn)行分子生物學(xué)的后續(xù)研究，如PCR、實時熒光定量PCR、蛋白質(zhì)組學(xué)和其他分析技術(shù)。顯微切割的發(fā)展經(jīng)歷了四個階段：手動直接顯微切割、機(jī)械輔助顯微切割、液壓控制顯微切割和激光顯微切割。

  激光顯微切割平臺

  徠卡顯微系統(tǒng)官網(wǎng)圖片來源

  19962000年，美國國家衛(wèi)生院國家腫瘤研究所**開發(fā)了基于近紅外激光熔膜原理的激光捕獲顯微切割技術(shù)DNA、RNA分析。第二年，美國Arcturus Engineering公司成功開發(fā)了激光捕獲顯微切割系統(tǒng)，實現(xiàn)了商業(yè)銷售。五年后，激光捕獲顯微切割成功應(yīng)用于植物研究，該技術(shù)在生物研究中發(fā)展迅速，得到廣泛應(yīng)用。激光顯微切割技術(shù)可以直接用激光取出顯微鏡下觀察到的目標(biāo)細(xì)胞。與早期技術(shù)相比，該技術(shù)具有快速、簡單、準(zhǔn)確、特異性強、精度高、細(xì)胞形態(tài)完整、細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)完整等優(yōu)點。

  激光顯微切割原理

  目前，基于近紅外激光，激光顯微切割可分為激光類型和技術(shù)原理（810nm波長）的LCM (激光捕獲顯微切割)和紫外激光（337～355nm波長）的LMD（激光顯微切割）兩種。前文所提的紡錘形神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄圖譜項目，采用的就是LCM技術(shù)。

  LCM 系統(tǒng)包括倒置顯微鏡、固態(tài)紅外激光二極管、激光控制裝置、控制顯微鏡載體平臺（固定載玻片）的操縱桿、電耦合相機(jī)和彩色顯示器。用于捕獲目標(biāo)細(xì)胞的熱塑料薄膜（乙烯乙酸乙烯酯，EVA）直徑通常為6mm，覆蓋在透明塑料帽上，后者與后續(xù)實驗使用的標(biāo)準(zhǔn) 相匹配0.5ml匹配離心管。

  LCM技術(shù)原理是將機(jī)械臂控制的收集管懸掛在組織切片上方。收集管的塑料帽表面有一層熱塑料薄膜（其*大吸收峰接近紅外激光波長）。在顯微鏡下選擇目標(biāo)細(xì)胞后，發(fā)射低能紅外激光脈沖，并立即加熱EVA膜融化與目標(biāo)細(xì)胞粘合，然后迅速凝固。然后目標(biāo)細(xì)胞粘附在塑料帽表面EVA薄膜和塑料帽一起移走。

  機(jī)械臂懸掛控制覆蓋熱塑膜的塑料帽，放置在脫水組織切片的目標(biāo)部位。顯微鏡直接選擇目標(biāo)細(xì)胞，發(fā)射激光脈沖，并立即加熱EVA局部熔化膜。熔化膜EVA膜滲透到切片上極小的組織間隙中，并在幾毫秒內(nèi)與目標(biāo)細(xì)胞粘合并迅速凝固。激光脈沖通常持續(xù)0．5～5．0毫秒，可以在整個塑料帽表面重復(fù)多次。當(dāng)組織和薄膜的附著力超過其與載玻片之間的附著力時，大量的目標(biāo)細(xì)胞可以快速分離。將塑料帽蓋在裝有緩沖液的離心管上，將分離的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，分析目標(biāo)細(xì)胞的分子生物學(xué)特征進(jìn)行后續(xù)研究。

  EVA膜約100～200μm厚，能吸收激光產(chǎn)生的大部分能量，瞬間將激光束照射區(qū)的溫度提高到90°C，保持幾毫秒后快速冷卻，確保生物大分子不受損壞。低能量紅外激光也可以避免損傷性光化學(xué)反應(yīng)。

  LCM其優(yōu)點是快速、簡單、準(zhǔn)確、無污染，適用于任何類型的玻璃，特別是低能量近紅外光，不直接接觸樣品，激光產(chǎn)生的大部分能量被熱塑料薄膜吸收，對樣品影響較小。

  而LMD該技術(shù)需要在薄膜載玻片或薄膜覆蓋的玻璃載玻片上安裝標(biāo)本切片。脈沖紫外激光（UV－A）物鏡聚焦在切片上，沿目標(biāo)區(qū)域邊緣移動切割，使選定區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞分離，周圍組織完好。由于紫外激光的波長非常接近生物組織的吸收峰值，常用于切割較厚的樣品組織。

  激光顯微切割技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀

  目前，激光顯微切割技術(shù)比以往的顯微切割技術(shù)取得了突破，已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)、癌癥研究、植物分析、法醫(yī)或氣候研究等領(lǐng)域。該方法也適用于細(xì)胞培養(yǎng)的操作或覆蓋玻璃的顯微雕刻。雖然應(yīng)用越來越廣泛，但也有一些問題需要解決，如設(shè)備成本，組織切片需要固定和染色，可能會影響細(xì)胞的狀態(tài)和RNA、蛋白質(zhì)的變化等。

  目前，美國賽默飛世爾、德國徠卡、德國蔡司和瑞士、瑞士等激光顯微切割平臺MMI，推出世界上**個商用激光捕獲顯微切割系統(tǒng)Arcturus賽默飛世爾于2010年收購。賽默飛世爾 旗艦產(chǎn)品ArcturusXT是**將以紅外為基礎(chǔ)的LCM以紫外線為基礎(chǔ)LMD蔡司、徠卡和MMI目標(biāo)細(xì)胞只能用紫外激光切割和收集。

  ArcturusXT激光捕獲顯微切割系統(tǒng)有一個開放的平臺，可以升級和擴(kuò)展應(yīng)用程序，以滿足不斷變化的研究需求。例如，其開放的顯微鏡接口可以讓用戶修改系統(tǒng)，增加高分辨率的相機(jī)，以獲得更準(zhǔn)確的圖像。開放式系統(tǒng)設(shè)計還實現(xiàn)了載體平臺插入板的輕松交換，可以容納神經(jīng)生物學(xué)研究中使用的更大的樣本形式。

  徠卡提供LMD6500和LMD7000激光顯微切割系統(tǒng)利用紫外激光分離顯微鏡下的目標(biāo)區(qū)域，并通過重力的溫和方法收集樣品。在徠卡的兩個系統(tǒng)中，高精度的光學(xué)元件被用來控制激光束的運動。光束焦點具有自動校正功能，可在自動模式和交互模式中切換，顯微鏡樣品平臺和樣品本身保持不變。通過這種專利方法，它可以達(dá)到超出想象的精度。

  瑞士MMI公司主推CellEctor Plus和CellCut Plus激光顯微切割系統(tǒng)利用固態(tài)紫外激光切割和收集組織切片等樣本中的目標(biāo)細(xì)胞。在整個分離過程中，激光不接觸需要分離的樣本，對樣本的損傷較小，以確保樣本RNA完整性。該系統(tǒng)用于樣本收集PTP（Predefined Target Positioning）該技術(shù)將粘性管蓋劃分為多個區(qū)域，粘附和收集組織切片中的同類細(xì)胞，提高樣品的收集效率，節(jié)約成本；下游核酸和蛋白質(zhì)實驗有足夠的樣本量。

  蔡司的PALM MicroBeam聚焦激光束也用于切割和分離樣本，但它收集樣本的方式更為特殊。細(xì)胞通過激光誘導(dǎo)的壓力波彈入管內(nèi)。MicroBeam彈射力就像光誘導(dǎo)的微爆炸發(fā)生在你的樣品下面，然后沖擊波向上推動組織。對于較大的區(qū)域，MicroBeam粘性管蓋也可以使用。請說明轉(zhuǎn)載: